მიმდინარე პროექტები

ღვიძლის ასოცირებული დანაწევრება და პორტული ვენის გადაკვანძვა ეტაპობრივი ჰეპატექტომიისათვის და ცალკეული წილის რეცელულარიზაცია: არის განსხვავება ღეროვანი უჯრედების დამატებით და მის გარეშე მიმდინარე ღვიძლის რეგენერაციას შორის?! (ექსპერიმენტული კვლევა)

კვლევების ხელმძღვანელი – პროფ. დიმიტრი კორძაია

 დღეისათვის ღვიძლის ტრანსპლანტაცია მიჩნეულია ამ ორგანოს დიფუზური დაზიანებით ან დიდი ზომის მოცულობითი წარმონაქნით გამოწვეული ღვიძლის შეუქცევადი უკმარისობის მკურნალობის უკანასკნელ იმედად. ამასთანავე, დონორ ორგანოთა მწვავე დეფიციტი (1) განაპირობებს მკურნალობის ალტერნატიული მეთოდების ინტენსიურ ძიებას (2).

ეს ძიება ვითარდება ორი სტრატეგიული მიმართულებით:

1. ბიოინჟინერია – როგორც ორგანოს ჩანაცვლებითი თერაპია, რომელიც ეფუძნება:

ა) უჯრედულ თერაპიას, მათ შორის ღეროვანი უჯრედებით თერაპიას: მაგალითად, ძვლის ტვინის (მეზენქიმური) ღეროვანი უჯრედების ინფუზია ააქტიურებს ღვიძლის პროგენიტორი უჯრედების პროლიფერაციას და ახდენს ღვიძლის რეპოპულაციას მათი ფენოტიპის შეცვლით. ამასთანავე, მეზენქიმურ ღეროვან უჯრედებს თავის მხრივ შეუძლიათ დიფერენცირდნენ როგორც ჰეპატოციტებად, ასევე ქოლანგიოციტებად (3–5).  

ბ) სასიგნალო მოლეკულებით ზემოქმედებას: მაგალითად, დადასტურებულია ინსულინის მსგავსი ზრდის ფაქტორის, ეპიდერმული ზრდის ფაქტორის, ჰეპატოციტების ზრდის ფაქტორის, ტრანსფორმული  ზრდის ფაქტორ ალფა-ს, ინტერლეიკინ-6-ის და ა.შ  ღვიძლის   რეგენერაციის მასტიმულირებელი უნარი. მათი დამატება აღძრავს ჰემიჰეპატექტომიის შემდგომ დარჩენილი უჯრედების ხელახალ შესვლას სასიცოცხლო ციკლში, ღვიძლის მასის ზრდას და ღვიძლის ქსოვილის რემოდელირებას (6,7).

გ) ბიოსკაფოლდების ცელულარიზაციით ქსოვილის (ორგანოს) ხელოვნურად გამოზრდას: ექსპერიმენტებში შესწავლილია როგორც ინ-ვიტრო დეცელულარიზებული ღვიძლის სკაფოლდების რეცელულარიზაცია და ტრანსპლანტაცია (8), ისე ინ-ვივო დეცელულარიზებული ღვიძლის წილის რეცელულარიზაცია ღვიძლის უჯრედებით (9); ასევე შემოთავაზებულია დეცელულარიზებული პლაცენტის გამოყენება ბიოსკაფოლდად (10).

უახლესი კვლევა ადასტურებს, რომ ასევე შესაძლებელია ვასკულარიზებული და მოფუნქციე „ღვიძლის“ წარმოქმა ადამიანის ენდოდერმულ ეპითელურ, ენდოთელურ და მეზენქმურ ღეროვან უჯრედებისგან ინ ვიტრო სამშრიან კულტურაში „გამოზრდილი“ღვიძლის კვირტის (iPSC-LBs) ინ ვივო ტრანსპლანტაციით. ტრანსპლანტატის შემდგომი მომწიფება ხდება ემბრიოგენეზში აღწერილი ღვიძლის განვითარების მსგავსად (11):   ტრანსპლანტაციიდან 48 საათში მასპინძელი ორგანიზმის სისხლძარღვებთან დაკავშირებით iPSC-LBs ტრანსპლანტის სისხლძარღვოვანი ქსელი ფუნქციონირებადი ხდება, რაც ასტიმულირებს გადანერგილი ღვიძლის კვირტის მომწიფებას. ეს დასტურდება  მის მიერ ღვიძლის სპეციფიური პროტეინების – ალფა-ფეტო პროტეინის, რეტინოლ შემბოჭველი პროტეინ 4-ის, ტრანსთირეტინის და ალბუმინის წარმოქმნით  (12).

1. ქირურგიულ მიდგომები, რომელიც იძლევა ადრე არაოპერაბელურად მიჩნეული ღვიძლის მასიური მოცულობითი პროცესების (სიმსივნეების) ამოკვეთის (ღვიძლის გაფართოებული რეზექციის) საშუალებას:

ა)  ღვიძლის გაფართოებული და ატიპური ექსტრაკორპორული რეზექციები შემდგომი რეპლანტაციით,  დროებითი პორტოკავალური შუნტირების გამოყენებით. (13).

ბ) ღვიძლის ასოცირებული დანაწევრება და პორტული ვენის გადაკვანძვა ეტაპობრივი ჰეპატექტომიისათვის (ALPPS), პათოლოგიური ქსოვილის მომმარაგებელი კარის ვენის ტოტ(ებ)ის დახშობას და  ღვიძლის ჯანმრთელი ქსოვილის ინ-ვივო „გაზრდას“ იმდენად, რომ მეორე ეტაპად ღვიძლის დიდი ზომის პათოლოგიური კერის ამოკვეთა აღარ იწვევს ღვიძლის უკმარისობის განვითარებას. ALPPS-ის მეთოდიკა შემუშავებულია როგორც ადამიანებში, ისე სხვადასხვა ექსპერიმენტულ მოდელებში, მათ შორის მცირე ზომის მღრღნელებში (14–17).

პროექტი მიზნად ისახავს დასახელებული სტრატეგიული მიმართულების  სამი მდგენელის – ALPPS -ის, ღეროვანი უჯრედებით თერაპიისა და ბიოსკაფოლდის ინ ვივო ცელულარიზაციის  – გაერთიანებას (ინტეგრაციას) ისეთი მეთოდის შემუშავების ხელშეწყობის მიზნით, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას  ღვიძლის როგორც შემოფარგლული  (მოცულობითი), ისე დიფუზური დაზიანებების სამკურნალოდ, როგორც ტრანსპლანტაციის ალტერნატივა.

ცნობილია, რომ ღვიძლის ერთი ნაწილის კარის ვენის ტოტის დახშობის შედეგად ღვიძლის დაუზიანებელი ნაწილის  რეგენერაცია შესაძლებელია მიმდინარეობდეს პოსტრეზექციული რეგენერაციისაგან განსხვავებული სასიგნალო მექანიზმებით (18). ონტოგენეზში, ღვიძლის მორფოგენეზის დროს ხდება როგორც ღვიძლის უჯრედების, ისე წილაკების  პროლიფერაცია. ღვიძლის რეგენერაციის დროს კი, ონტოგენეზური ზრდისაგან განსხვავებით, ხდება უჯრედების გამრავლება წილაკების რაოდენობის მომატების გარეშე (19). ონტოგენეზში წილაკების რაოდენობის მატებას განაპირობებს მორფოგენეზის გენები, რომლებიც მორფოგენეზის დასასრულისათვის ინაქტიურდება. რითაც აიხსნება ზრდასრულ ძუძუმწოვრებში ჰეპატოციტთა პროლიფერაციითა და პოლიპლოიდიზაციით მიმდინარე ღვიძლის რეგენერაციის დროს წილაკთა რაოდენობის უცვლელობა.

დღეისათვის დადასტურებულად ითვლება ღეროვანი უჯრედების მონაწილეობა ჰემიჰეპატექტომიის შემდგომ ღვიძლის რეგენერაციაში. ღეროვანი უჯრედები, ერთი მხრივ, გამოყოფენ ფაქტორებს, რომლებიც იწვევს პროლიფერაციული პროცესების (მიტოზების, პოლიპლოიდიზაციის) აქტივაციას, ხოლო მეორე მხრივ, თავად განიცდიან დიფერენციაციას სხვადასხვა ხაზის უჯრედებად (ჰეპატოციტები, ქოლანგიოციტები, ენდოთელიოციტები) და მონაწილეობენ ღვიძლის ქსოვილის რეპოპულაციაში (20–22).

უკანასკნელ პერიოდში მიღებულ იქნა მონაცემები იმის თაობაზე, რომ ღვიძლის გაფართოვებული რეზექციის დროს, ღვიძლის ინტაქტურ ნაწილში (წილში) ჰომოლოგიური ღეროვანი უჯრედების შეყვანა დაზიანებული ნაწილის პორტული ვენის ემბოლიზაციის ფონზე იწვევს მომავალში ღვიძლის დარჩენილი ნაწილის უფრო სწრაფ და მეტად გაზრდას, ვიდრე ეს ხდება მხოლოდ კარის ვენის ოკლუზიის და/ან პარციული ჰეპატექტომიის პირობებში (23,24). იგივე მონაცემები დასტურდება ALPPS-ის მიმართაც (17).

იმის გათვალისწინებით, რომ ცნობილი გახდა ენდოდერმული, მეზენქიმური და ენდოთელური პლურიპოტენტული ღეროვანი უჯრედებიდან სამგანზომილებიანი სტრუქტურის მქონე ისეთი „ღვიძლის კვირტის“ ფორმირება in vitro,  რომელსაც გააჩნია in vivo ჰემოცირკულაციაში ჩართვის უნარი (12), მნიშვნელოვანი ხდება ALPPS-ის დროს ღვიძლის ინტაქტურ წილში ღეროვანი უჯრედების შეყვანის შემდგომი რეგენერაციის მორფოლოგიის „გადახედვა“.

ასევე, ღვიძლის ინ ვივო რეცელულარიზებული წილის ფუნქციონირების დადასტურებამ 6 საათის განმავლობაში (9) წარმოქმნა დამატებითი კვლევების აუცილებლობა რეცელულარიზებული წილის ფუნქციონირებაზე ხანგრძლივად დაკვირვების მიზნით. 

ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ მეზენქიმური ღეროვანი უჯრედებისა და ჰეპატოციტების ზრდის ფაქტორის კოქტეილის ინტრაპორტულ ინფუზიას შეუძლია უზრუნველყოს როგორც ინ-ვივო რეცელულარიზებული ღვიძლის წილის წარმატებული გრძელვადიანი ფუნქციონირება, ასევე რეზექციის შემდეგ დარჩენილი   ღვიძლის (წილების)  რეგენერაციის აქსელერაცია ALPPS-ის დროს. ამასთანავე, ეს რეგენერაცია შესაძელებელია დაფუძნებული იყოს არა მარტო პროლიფერაციულ, პროცესებზე, არამედ მორფოგენეზის მსგავსი პროცესების ინდუქციაზეც, რომლის დროსაც ხდება ღვიძლის კვირტის მსგავსი სტრუქტურების წარმოქმნა და მომწიფება (ახალი წილაკების განვითარება). 

კვლევის მიზანია ზემოთ ჩამოყალიბებული ჰიპოთეზის შემოწმება, კერძოდ: მეზენქიმური ღეროვანი უჯრედების და ჰეპატოციტების ზრდის ფაქტორის კოკტეილის ინტრაპორტულად ინფუზიის შემდეგ ღვიძლის რეგენერაციისა და რეცელულარიზაციის დინამიკის, ხარისხისა და სტრუქტურული თავისებურებების გამოკვლევა ALPPS-ის და ღვიძლის ერთი წილის ინ-ვივო დეცელულარიზაციის მოდელებში და მათ კომბინაციაში – ღვიძლის დიფუზური პათოლოგიის და/ან დიდი მოცულობითი პროცესების მკურნალობისათვის ღვიძლის ტრანსპლანტაციის ალტერნატიული მეთოდების შემუშავების ხელშეწყობისათვის

კვლევის ამოცანები:

1. ექსპერიმენტებისათვის საჭირო მატერიალურ-ტექნიკური ბაზის (ლაბორატორიების) მომარაგება რეაქტივებით, მარკერებით (ანტისხეულებით), სასიგნალო მოლეკულებით (ჰეპატოციტების ზრდის ფაქტორი) და საცდელი ცხოველების (Wistar-Tg(CAG-GFP)184Ys და Wistar outbred rat: RjHan:WI) შეძენა, კარანტინი და „ჰაუსინგი“;
2. ექსპერიმენტული მოდელების (ALPPS-ის და ღვიძლის ერთი წილის ინ-ვივო დეცელულარიზაციის მოდელები და მათი კომბინაცია) და ლაბორატორიული ტექნოლოგიების (მეზენქიმური ღეროვანი უჯრედების და ჰეპატოციტების ზრდის ფაქტორების საინფუზიო კოკტეილის შექმნა (კოქტეილის შესაქმნელად გაოიყენება კომპანია Sin Biological-ის ჰეპატოცისტის ზრდის ფაქტორი, რომელიც წარმოადგენს მულტიფუნქციურ ციტოკინს და პასუხისმგებელია მრავალ ბიოლოგიურ პასუხზე, მათ შორის უჯრედების პროლიფერაცია/გადარჩენა, ანგიოგენეზი, მორფოგენეზი და მოტოგენეზი(25)); კოროზიული პრეპარატების შექმნა; იმუნოჰისტოქიმიური და მორფომეტრიული კვლევა; ღვიძლის სპეციფიკური ცილებისა [HDP] და მათი გენების კვლევა) პროტოკოლების შემუშავება და ტესტირება;
3. ღვიძლის წილის რეცელულარიზაციის დინამიკის, ეფექტურობის (efficiency) ხარისხისა და სტრუქტურული თავისებურებების გამოკვლევა – 1 წილის ინ-ვივო დეცელულარიზაციის მოდელში, ღეროვანი უჯრედების და ზრდის ფაქტორების კოკტეილის ინტრაპორტული ინფუზიის პირობებში და ALPPS-თან კომბინაციაში;
4. ღვიძლის რეგენერაციის დინამიკის, ეფექტურობის (efficiency) ხარისხისა და სტრუქტურული თავისებურებების გამოკვლევა ALPPS-ის მოდელში, ღეროვანი უჯრედების და ზრდის ფაქტორების კოკტეილის ინტრაპორტული ინფუზიის პირობებში და 1 წილის ინ-ვივო დეცელულარიზაციის მოდელთან კომბინაციაში;
5. ექსპერიმენტული მასალის მორფოლოგიური, ბიოქიმიური და მოლეკულურ-ბიოლოგიური გამოკვლევა; გამოკვლევის შედეგების ფიქსირება ციფრული ფოტოებისა და ცხრილებისა სახით.
6. კვლევის შედეგების ანალიზი და პრეზენტაცია საუნივერსიტეტო და საერთაშორისო კონფერენციაზე. პუბლიკაცი(ებ)ის მომზადება.

ცხოველებთან მოპყრობისას დაცული იქნება საერთაშორისო მოთხოვნები (26–28).

 მოსალოდნელი შედეგები:

დაგეგმილმა კვლევის შედეგებმა უნდა დაადასტუროს:

• ღვიძლის ინ ვივო რეცელულარიზებული წილის ხანგრძლივად ფუნქციონირების შესაძლებლობა;
• ALPPS-ის მოდელში მეზენქიმური ღეროვანი უჯრედების და ჰეპატოციტების ზრდის ფაქტორების ინტრაპორტული ინფუზიის ფონზე ღვიძლის წილების (FLR) რეგენერაციის აქსელერაცია არა მხოლოდ უჯრედთა პროლიფერაციის, არამედ ახალი სტრუქტურული ერთეულების (წილაკების) შექმნის ხარჯზეც;

კვლევები ითვალისწინებს 2 სადოქტორო პროგრამის რეალიზაციას თსუ მედიცინის ფაკულტეტის დოქტორანტების მონაწილეობით;

 

ლიტერატურა

1. Klein AS, Messersmith EE, Ratner LE, Kochik R, Baliga PK, Ojo AO. Organ Donation and Utilization in the United States, 1999-2008. Am J Transplant [Internet]. 2010 Apr 1 [cited 2017 Jul 9];10(4p2):973–86. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1600-6143.2009.03008.x
2. Kim Y, Ozer S, Uygun BE. Liver Regeneration. In: Regenerative Medicine Applications in Organ Transplantation [Internet]. Elsevier; 2014 [cited 2017 Jul 9]. p. 333–52. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/B9780123985231000240
3. Zhang W, Tucker-Kellogg L, Narmada B. Cell-delivery therapeutics for liver regeneration. Adv drug Deliv [Internet]. 2010 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X10000694
4. Dhawan A, Puppi J, Hughes R, Mitry R. Human hepatocyte transplantation: current experience and future challenges. Nat Rev [Internet]. 2010 [cited 2017 Jul 9]; Available from: https://www.nature.com/nrgastro/journal/v7/n5/abs/nrgastro.2010.44.html
5. Espejel S, Roll G, McLaughlin K, Lee A. Induced pluripotent stem cell–derived hepatocytes have the functional and proliferative capabilities needed for liver regeneration in mice. J Clin [Internet]. 2010 [cited 2017 Jul 9]; Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2929736/
6. Francavilla A, Starzl T, Porter K, Foglieni C. Screening for candidate hepatic growth factors by selective portal infusion after canine Eck’s fistula. 1991 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.1840140415/full
7. Noguchi S, Ohba Y, Oka T. Influence of epidermal growth factor on liver regeneration after partial hepatectomy in mice. J Endocrinol [Internet]. 1991 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://joe.endocrinology-journals.org/content/128/3/425.short
8. Jiang W-C, Cheng Y-H, Yen M-H, Chang Y, Yang VW, Lee OK. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering HHS Public Access. Biomaterials [Internet]. 2014 [cited 2017 Jul 3];35(11):3607–17. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4678102/pdf/nihms-742200.pdf
9. Pan J, Yan S, Gao J, Wang Y, Lu Z, Cui C. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. Int J [Internet]. 2016 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1357272516303028
10. Kakabadze A, Kakabadze Z. Prospect of using decellularized human placenta and cow placentome for creation of new organs: targeting the liver (part I: anatomic study). Transplant Proc [Internet]. 2015 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041134515002274
11. Matsumoto K, Yoshitomi H, Rossant J, Zaret K. Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function. Science (80- ) [Internet]. 2001 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://science.sciencemag.org/content/294/5542/559.short
12. Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature [Internet]. 2013 [cited 2017 Jul 9]; Available from: https://www.nature.com/nature/journal/v499/n7459/abs/nature12271.html
13. Wen P, Lin K, Chen Y, Hsieh C, Ko C. Extracorporeal hepatic resection and autotransplantation using temporary portocaval shunt provides an improved solution for conventionally unresectable. Dig Dis [Internet]. 2013 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://link.springer.com/article/10.1007/s10620-013-2801-z
14. Budai A, Fulop A, Hahn O, Onody P, Kovacs T. Animal Models for Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy (ALPPS): Achievements and Future Perspectives. Eur Surg [Internet]. 2017 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://www.karger.com/Article/FullText/453108
15. Trenard H, Moulin L, Padín J, Stringa P. Development of an experimental model of portal vein ligation associated with parenchymal transection (ALPPS) in rats. Cirugía Española ( [Internet]. 2014 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2173507714004578
16. Wei W, Zhang T, Zafarnia S, Schenk A, Xie C, Kan C. Establishment of a rat model: Associating liver partition with portal vein ligation for staged hepatectomy. Surgery [Internet]. 2016 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039606015010338
17. Zhang G, Zhang Z, Lau W, Chen X. Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy (ALPPS): a new strategy to increase resectability in liver surgery. Int J Surg [Internet]. 2014 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1743919114000727
18. Tashiro S. Mechanism of liver regeneration after liver resection and portal vein embolization (ligation) is different? J Hepatobiliary Pancreat Sci [Internet]. 2009 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1007/s00534-009-0058-x/full
19. Papp V, Dezsö K, László V, Nagy P. Architectural changes during regenerative and ontogenic liver growth in the rat. Liver [Internet]. 2009 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lt.21665/full
20. Fausto N. Liver regeneration and repair: hepatocytes, progenitor cells, and stem cells. Hepatology [Internet]. 2004 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.20214/full
21. Duncan A, Dorrell C, Grompe M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology [Internet]. 2009 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001650850900818X
22. Than N, Newsome P. Stem cells for liver regeneration. QJM An Int J [Internet]. 2014 [cited 2017 Jul 9]; Available from: https://academic.oup.com/qjmed/article-abstract/107/6/417/1562604
23. Esch J am, Knoefel W, Klein M, Ghodsizad A. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration. Stem [Internet]. 2005 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1634/stemcells.2004-0283/full
24. AM E, II J. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration. Stem Cells [Internet]. 2005 [cited 2017 Jul 9]; Available from: http://ci.nii.ac.jp/naid/30013002330/